Invitrogen核/膜系統一、實驗原理：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由DNA結合結構域(DNA—bindingdomain，BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，西寧酵母單雜交文庫實驗外包，AD)。用于酵母單雜交系統的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發揮作用。在GAL4系統中構建與基因的ORFs融合的激活結構域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD融合構建載體，分別轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若與順式作用元件發生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養缺陷型培養基上篩選陽性。基因轉錄實際上是轉錄調控因子和啟動子區各種順式作用元件相互作用的結果，這種結合猶如蛋白質與蛋白質的互作一樣具有特異廾性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質互作的基礎。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統一、實驗原理：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由DNA結合結構域(DNA—bindingdomain，BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，西安淳風生物科技有限公司，淳風生物科技，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發揮作用。在GAL4系統中構建與基因的ORFs融合的激活結構域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD融合構建載體，分別轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若與順式作用元件發生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，西寧酵母單雜交文庫實驗外包，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結丬合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養缺陷型培養基上篩選陽性。基因轉錄實際上是轉錄調控因子和啟動子區各種順式作用元件相互作用的結果，這種結合猶如蛋白質與蛋白質的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質互作的基礎。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2LR重組1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B1.4.4文庫克隆檢測1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定三、實驗結果：次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統一、實驗原理：真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，轉錄因子通常由DNA結合結構域(DNA—bindingdomain，BD)和轉錄激活結構域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發揮作用。在GAL4系統中構建與基因的ORFs融合的激活結構域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD融合構建載體，分別轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若與順式作用元件發生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養缺陷型培養基上篩選陽性。基因轉錄實際上是轉錄調控因子和啟動子區各種順式作用元件相互作用的結果，這種結合猶如蛋白質與蛋白質的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質互作的基礎。二、實驗步驟：1.1RNA提取1.2mRNA分離1.3cDNA初級文庫的構建1.3.1cDNA第一鏈的合成1.3.2cDNA第二鏈的合成1.3.3cDNAadapter的制備1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)1.3.5cDNA分級分離1.3.6BP重組1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B1.3.8文庫克隆檢測1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定1.4cDNA次級文庫的構建1.4.1初級文庫的質粒抽提1.4.2.淳風生物科技///西寧酵母單雜交文庫實驗外包