Invitrogen核/膜系統
一、 實驗原理：
酵母雙雜交系統是在酵母體內通過重建有活性轉錄因子的結構來鑒定蛋白質之間的相互作用。轉錄因子可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄因子上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(BindingDomain，BD)和轉錄激活結構域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄激活都是必須的。在GAL4系統中利用轉錄因子GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD與激活結構域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若發生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表冂達，在相應的營養缺陷型培養基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規模篩選分析蛋白質間的相互作用，是現在分子生物學與生物化學常用的手段。

二、實驗步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級文庫的構建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫克隆檢測
1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4  cDNA次級文庫的構建
1.4.1初級文庫的質粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫克隆檢測
1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實驗結果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，濟南酵母雙雜交文庫實驗外包
，平均插入片段大于1kb。
Invitrogen核/膜系統
一、 實驗原理：
酵母雙雜交系統是在酵母體內通過重建有活性轉錄因子的結構來鑒定蛋白質之間的相互作用。轉錄因子可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄因子上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(BindingDomain，BD)和轉錄激活結構域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄激活都是必須的。在GAL4系統中利用轉錄因子GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD與激活結構域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若發生相互作用時，濟南酵母雙雜交文庫實驗外包
，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養缺陷型培養基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規模篩選分析蛋白質間的相互作用，是現在分子生物學與生物化學常用的手段。

二、實驗步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級文庫的構建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫克隆檢測
1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4  cDNA次級文庫的構建
1.4.1初級文庫的質粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫克隆檢測
1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實驗結果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。
Invitrogen核/膜系統
一、 實驗原理：
酵母雙雜交系統是在酵母體內通過重建有活性轉錄因子的結構來鑒定蛋白質之間的相互作用。轉錄因子可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄因子上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(BindingDomain，BD)和轉錄激活結構域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄激活都是必須的。在GAL4系統中利用轉錄因子GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD與激活結構域GAL4-AD的特異載體，西安淳風生物科技有限公司，淳風生物科技，分別與基因的ORFs融亍合，轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若發生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養缺陷型培養基上篩選陽性。酵母雙雜交文庫的構建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規模篩選分析蛋白質間的相互作用，是現在分子生物學與生物化學常用的手段。

二、實驗步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級文庫的構建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫克隆檢測
1.3.9文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

1.4  cDNA次級文庫的構建
1.4.1初級文庫的質粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫克隆檢測
1.4.5文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定

三、實驗結果：
次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。

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