一、Western blot概述
Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質混合物,經過SDS-PAGE分離的蛋白質被到轉移到固相支撐物(NC膜,PVDF膜等)上后,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持膜上蛋白質或多肽的抗原性質不變,以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與其對應的抗體起免疫反應,再與酶標記的二抗體起反應,經過底物顯色以檢測特異蛋白質表達水平。
由于Western blot檢測技術具有簡便,快捷等特點,所以目前該技術也被廣泛應用于蛋白質表達水平的檢測。
二、技術服務服務內容
1、蛋白質抽提與定量;
2、Western blot
3、圖片分析;
4、Western blot實驗報告提交。
三、送樣須知,為了保證Western blot實驗能順利進行,樣品寄送需滿足以下要求:
顧客提供:組織、細胞、蛋白質溶液等;一抗(如果公司抗體庫里沒有)。
運輸要求:干冰或液氮包裝寄送,廣州本地客戶可上門收樣。
注:樣本應避免各類污染和反復凍融。
四、實驗報告內容
1、Western blot蛋白質濃度及電泳上樣量;
2、原始膠片和電子圖片、圖片分析結果;
3、Western blot完整的實驗報告,包括實驗步驟、使用儀器和試劑等。
五、實驗案例
六、服務周期及收費標準: 歡迎登陸 www.fitgene.com 服務熱線 400-699-1663
七、服務質量承諾:利用內參精確定量,并提供清晰、客觀的western結果。
附:Western blot 實驗步驟
1、Western blot蛋白質提取:根據實驗目的的不同選擇不同的裂解液,如RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液,同時根據蛋白質提取組分的不同選擇不同的方法,如提取核蛋白,細胞質蛋白,膜蛋白等。
2、蛋白定量,根據蛋白質的提取條件不同,可采取不同的定量方法,如bradford法、BCA法等。
3、電泳,依據需要檢測蛋白的分子量選取分離膠的濃度,分別配置分離膠和積成膠,凝膠凝固后進行蛋白質上樣和電泳。
4、轉膜,可采取半干法和濕法轉移,當采取半干法轉膜時需防止短路:從下到上的順序:濾紙/PVDF膜/凝膠/濾紙/陰極(bio-rad轉膜儀)。
5、封閉:5%脫脂奶粉或5% BSA封閉過夜或室溫1小時,孵育時間可根據實驗需要進行改變。
6、一抗孵育,5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度,與膜室溫孵育1小時4度過夜,孵育時間可參考抗體說明書,并加以優化,一抗孵育后TBST洗膜3次,每次5分鐘。
7、 二抗孵育,5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度,與膜室溫孵育1小時,TBST洗膜3次,每次5分鐘。
8、顯影(ECL法):將A、B兩種底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上,置于壓片盒中,迅速蓋上膠片,關閉膠盒進行曝光,曝光一定時間后取出膠片,浸入顯影液中顯影,直到出現清晰的蛋白質條帶,清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影,清水沖凈晾干,標定Marker,掃描膠片和Western blot 圖片分析。